2X AFT SYBR Premix EsTaq (with Tli RNaseH)

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友情提醒：您可以用以前的qPCR配置体系、以前的qPCR程序，一切照旧！（因此，不用看后面冗长的说明书）

【储存条件】 长期保存，请置于-20˚C，有效期24个月。经常使用，可置于4˚C保存至少六个月。

【产品简介】

本产品采用Sybrgreen嵌合荧光法进行荧光定量的专用试剂。制品中含有荧光定量反应的最适浓度Sybrgreen，是一种2×浓度的预混试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。制品中使用了antiTaq抗体的Hot Start法用DNA聚合酶，与荧光定量反应适合Buffer组合，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，可以进行高灵敏度的荧光定量扩增反应。

另外，本产品中添加了Tli RNaseH (耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以很好地抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。 适合于快速荧光定量扩增反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

【产品组份】

2x AFT SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) *        5x1ml          

ROX Reference Dye（50×）**                       200μl

ROX Reference Dye II（50×）**                     200μl

*由以下组分预混而成：EsTaq，dNTP Mixture，Mg²⁺，Tli RNaseH，Sybrgreen。

**  ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。例如使用 Applied Biosystems 的 Real Time PCR 扩增仪进行实验就需要校正。

◆ 需要使用 ROX Reference Dye 校正的仪器 Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)

◆ 需要使用 ROX Reference Dye II 校正的仪器 Applied Biosystems 7500 和 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)

◆ 不需要校正的仪器  Thermal Cycler Dice™ Real Time System III (Code No. TP950/TP970/TP980/TP990) Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Code No. TP700/TP760) Smart Cycler II System(Cepheid) LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)

【使用注意】

1．使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。但请勿涡旋振荡混匀。

2．Sybrgreen Premix EsTaq在-20℃存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。

3．配制反应液时，试剂请于冰上放置。反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。

4. 本制品中含有荧光染料 Sybrgreen，配制 PCR 反应液时应避免强光照射。

【所需试剂】

本产品为2×预混荧光定量PCR反应体系，使用时只需加入模板、引物和水，使其工作浓度为1×,即可进行反应。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度地减少人为误差、节约PCR实验操作时间、降低污染几率。

【操作示例】

注意：请严格按照不同仪器的操作手册进行实验。                                   

一、 以Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System

和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法为例

1、按下表配制PCR反应体系:

                  组分名称                                      50ul体系   20ul体系

*通常引物终浓度为0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

**ROX Reference Dye II(50x)比 ROX Reference Dye(50x)浓度低，使用 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II(50x)。 使用 ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System 和 StepOnePlus 时，请使用 ROX Reference Dye(50×)。

*** 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量要在100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时需要进行梯度稀释，以确定合适的 DNA 模板添加量。

如果欲使用本产品进行Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。

2、进行 荧光定量PCR 反应

< Applied Biosystems 7300/7500 和 StepOnePlus Real-Time PCR System >

两步法 PCR 扩增标准程序：  

Stage 1：预变性       循环数：1      

95℃  30 秒  

Stage 2：PCR 反应    循环数：40      

95℃  5 秒      

60℃  30～34 秒*               

Dissociation stage    *

使用 StepOnePlus 时请设定  在 30 秒。

使用 7300 时请设定在 31 秒。                                                      

使用 7500 时请设定在 34 秒。     

<Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System>

两步法 PCR 扩增标准程序：

Stage 1： 预变性        循环数: 1

95℃  30 秒

Stage 2： PCR 反应    循环数: 40

95℃  3 秒

60℃  30 秒

Stage 3： Melt Curve  

注意：

1） 本产品是利用anti-Taq 抗体的Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。

2） 如果以上两步法程序得不到良好的实验结果时，请再进行 PCR 条件的优化。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。

3、标准曲线制作和结果分析

反应结束后确认荧光定量PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。

分析方法参见仪器的操作手册。

二、 以 LightCycler/LightCycler480 System的操作方法为例

1、按下表配制PCR反应体系:

                          组分名称                                      20ul体系

*通常引物终浓度为0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

** 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量要在100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时需要进行梯度稀释，以确定合适的 DNA 模板添加量。

如果欲使用本产品进行Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。

2、进行 荧光定量PCR 反应

PCR 反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入 LightCycler 中进行荧光定量PCR反应。建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。

< LightCycler> 两步法 PCR 扩增标准程序：  

Stage 1：预变性       循环数：1      

95℃  30 秒           20℃/秒

Stage 2：PCR 反应    循环数：40      

95℃  5 秒            20℃/秒

60℃  20 秒           20℃/秒               

Stage 3：融解曲线分析  

95℃      0 秒  20℃/秒

65℃     15 秒  20℃/秒

95℃      0 秒  0.1℃/秒

< LightCycler 480 System>两步法 PCR 扩增标准程序：

变性

95℃    30 秒（Ramp rate：4.4℃/秒）

1 cycle

PCR

分析模式：定量分析

95℃ 5 秒 (Ramp rate：4.4℃/秒)

60℃ 30 秒. (Ramp rate：2.2℃/秒，Acquisition Mode : Single)

40 cycles

融解

分析模式：融解曲线

95℃ 5 秒 (Ramp rate：4.4℃/秒)

60℃ 1 分钟 (Ramp rate：2.2℃/秒)

95℃ (Ramp rate：0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)

1 cycle

降温

50℃ 30 秒 (Ramp rate：2.2℃/秒)

1 cycle

注意：

本产品是利用anti-Taq 抗体的Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。

3、标准曲线制作和结果分析

反应结束后确认荧光定量PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。

分析方法参见仪器的操作手册。

三、 以 Smart Cycler  II System的操作方法为例

1、按下表配制PCR反应体系:

                          组分名称                                      25ul体系

*通常引物终浓度为0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

** 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量要在100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时需要进行梯度稀释，以确定合适的 DNA 模板添加量。

如果欲使用本产品进行Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。

2、进行 荧光定量PCR 反应

PCR 反应管请用离心机轻轻离心后放入 Smart Cycler 中进行荧光定量PCR 反应。建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。

两步法 PCR 扩增标准程序：  

Stage 1：预变性  

Hold  

95℃  30 秒

Stage 2：PCR 反应  

循环数：40  

95℃  5 秒  

60℃  20 秒

Stage 3：Melt Curve      

注意：

本产品是利用anti-Taq 抗体的Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。

3、标准曲线制作和结果分析

反应结束后确认荧光定量PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。

分析方法参见仪器的操作手册。

四、 以CFX96 Real-Time PCR Detection System的操作方法为例

1、按下表配制PCR反应体系:

                          组分名称                                      25ul体系

*通常引物终浓度为0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

** 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量要在100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时需要进行梯度稀释，以确定合适的 DNA 模板添加量。

如果欲使用本产品进行Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。

2、进行 荧光定量PCR 反应

建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。

两步法 PCR 扩增标准程序：

样品体积：25 μl   

Step 1：95℃  30 秒

Step 2：PCR 反应  

GOTO：39（40 Cycles）  

95℃  5 秒  

60℃  30 秒  

Step 3：Melt Curve       

注意：

本产品是利用anti-Taq 抗体的Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。

3、标准曲线制作和结果分析

反应结束后确认荧光定量PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。

分析方法参见仪器的操作手册。

五、 以Thermal Cycler Dice Real Time System III and Lite 的操作方法为例

1、按下表配制PCR反应体系:

                          组分名称                                      25ul体系

*通常引物终浓度为0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

** 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量要在100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时需要进行梯度稀释，以确定合适的 DNA 模板添加量。

如果欲使用本产品进行Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。

2、进行 荧光定量PCR 反应

建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。

两步法 PCR 扩增标准程序：

Stage 1：预变性      

Repeat：1       

95℃  30 秒    

Stage 2：PCR 反应      

Repeat：40

95℃  5 秒      

60℃  30 秒   

Stage 3：Dissociation       

注意：

本产品是利用anti-Taq 抗体的Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。

3、标准曲线制作和结果分析

反应结束后确认荧光定量PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。

分析方法参见仪器的操作手册。

【实验条件优化】

如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和 PCR 反应条件的优化。另外，根据反应情况选择特异性不同的qPCRmix， 可提高 PCR 反应性能。 实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，才可以在较大浓度范围内进行很好的定量。

A、反应特异性高的实验体系应具备以下条件： ž

No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。 ž

不产生目的片段以外的扩增。

B、扩增效率高的实验体系应具备以下条件：

扩增产物起峰更早（Ct 值小）。 ž

PCR 扩增效率高（接近理论值 100％）。

C、降低 Primer 浓度有助于提高特异性；提高 Primer 浓度有助于提高扩增效率。

D、要提高反应特异性，可以提高退火温度。要提高扩增效率，可以增加延伸时间或变为 3 Step PCR反应。

E、预变性条件通常设定为 95℃ 30秒，使用此条件对于难变性的环状质粒 DNA 和基因组 DNA 模板 基本上也能够很好的变性。如果对难变性的模板想改变变性条件，可以延长至 1～2 分钟。但是时 间过长酶容易失活，不推荐使用 2 分钟以上的变性条件。

【引物设计】

进行荧光定量PCR 反应时，设计反应性能良好的 PCR 引物非常重要。根据以下原则，可以设计 PCR 扩增效率高，反应特异性强的良好引物。PCR 扩增产物长度： 80～150 bp 较为合适（可以延长至 300 bp）。

设计引物要求如下：

A、 引物长度： 17～25 mers

B、 GC 含量： 40～60%（45～55%理想）

C、 Tm 值：Forward Primer 和 Reverse Primer 的 Tm 值不能相差太大。

Tm 值的计算使用专用软件。 OLIGO： 63～68℃     Primer3：60～65℃ 

D、 引物序列：A、G、C、T 整体分布尽量均匀。

不要有部分的 GC rich 或 AT rich（特别是 3’端）。

避开 T/C（Polypyrimidine）或 A/G（Polypurine）的连续结构。

E、3’末端序列：避免 GC rich 或 AT rich。

3’端碱基最好为 G 或 C。

尽量避免 3’末端碱基为 T。

E、 互补序列：避开引物内部或两条引物之间有 3 个碱基以上的互补序列。

两条引物间的 3’末端避开有 2 个碱基以上的互补序列。

特异性 使用 BlAST *3检索确认引物的特异性。 *